Laitteistot ja menetelmät Puhdistus- menetelmät Pylväskromatografia

> Teoria Video Harjoitukset

Mitä on pylväskromatografia?

Pylväskromatografia on pylvään avulla suoritettava kromatografinen erotusmenetelmä. Pylväskromatografiassa on kaksi faasia; paikallaan pysyvä stationäärifaasi ja liikkuva faasi, joiden välillä aineiden erottuminen tapahtuu. Pylväskromatografiassa stationäärifaasina toimii adsorbenssigeeli (useimmiten silikageeli tai alumiinioksidi) ja liikkuvana faasina jokin liuotin tai liuotinseos.

Pylväskromatografiassa raakatuote eluoidaan soveltuvalla liuottimella tai liuotinseoksella pylvääksi pakatun adsorbentin läpi, jolloin eri tavoin pylvääseen pidättyvät yhdisteet tulevat eri aikoina pylväästä ulos. Vaihtamalla ulostulevan eluentin keräysastiaa ja seuraamalla ulostulevan eluentin koostumusta TLC:n avulla, saadaan pylväässä eroavat yhdisteet erotettua toisistaan.

Milloin pylväskromatografiaa käytetään?

Pylväskromatografiaa käytetään näytteen puhdistukseen ja fraktiointiin. Orgaanisten yhdisteiden syntetiikassa on erittäin tavallista, että reaktiossa syntyy halutun yhdisteen ohella sivutuotteita, joiden fysikaaliset ominaisuudet poikkeavat halutusta tuotteesta ja lähtöaineista vain vähän. Lisäksi, kun useat orgaaniset yhdisteet ovat haihtumattomia ja niiden kiteyttäminen voi olla ongelmallista, olisi niiden puhdistaminen yksinkertaisemmilla menetelmillä vaikeaa tai mahdotonta. Oikein valitussa kromatografisessa systeemissä saadaan rakenteeltaan hyvinkin samankaltaiset yhdisteet useimmiten erotettua toisistaan. Pylväskromatografia on yksi yleisimmin käytetty kromatagrafian laji.

Mitä pylväskromatografiassa tarvitaan?

pylväskromatografia:

• pylväs
• statiivi, koura ja kaksoispuristin
• adsorbenssi (esim. silikageeli)
• eluentti
• paljon koeputkia
• TLC välineet >> TLC

Sopivan eluentin etsiminen tapahtuu yleensä ohutkerroskromatografian (TLC) avulla. Myös ulostulevan eluentin koostumusta seurataan TLC:llä.

Miten suoritetaan pylväskromatografia?

Aluksi etsitään sopiva liuotinsysteemi ohutkerroskromatografian avulla. Kolonnin pohjalle laitetaan pieni pala pumpulia estämään geelin ja hiekan valumista. Pylväät voivat olla myös varustettu sintterillä, jolloin pumpulia ei tarvita. Pumpulin tai sintterin päälle lisätään hiekkaa kolonnin kapean osan verran. Geeli (30-100-kertainen määrä seokseen nähden) voidaan lisätä pylvääseen joko kuivana tai sekoittamalla se tarpeelliseen määrään eluenttia. Yleensä suositellaan käyttämään märkäpakkausta silikageelille ja kuivapakkausta alumiinioksidille. Jos geeli lisätään pylvääseen kuivana, niin tämän päälle kaadetaan liuotinta. Geelipatsaan yläpinnan tulee olla suorassa. Kolonniin lisätään vielä hiekkaa. Hiekkapatsaan korkeuden tulee olla noin 1 cm.

Ylimääräinen eluentti lasketaan pois siten, että nesteen rajapinta tulee samalle korkeudelle kuin hiekan yläpinta. Raakatuote liuotetaan pieneen määrään eluenttia ja lisätään se varovasti pylvään yläpäähän. Nestepinta lasketaan jälleen hiekan yläreunan tasolle. Kolonnin yläosa huuhdellaan vielä pienellä määrällä liuotinta ja nestepinta lasketaan hiekan yläreunan tasolle. Liuotinta lisätään (rikkomatta hiekan pintaa) ja suoritetaan varsinainen eluointi. Hanasta lasketaan eluenttia keräysastioihin. Eluenttia lisätään tarvittaessa, sillä geeliä ei saa päästää kuivaksi.

Kerätyt fraktiot analysoidaan TLC:n avulla.